細胞光毒性試驗原理和實驗步驟

為什么要對藥物進行光毒性試驗？

>雖然許多藥物和日化用品對人體不會造成直接的傷害，但在紫外線的作用下，例如日光照射、紫外環(huán)境下操作條件下便會發(fā)生化學反應(yīng)，從而引發(fā)皮膚過敏癥或者其他形式的傷害，專業(yè)上稱之為化學品具有的光毒性傷害。對此類化學制品進行光毒性檢測實驗可以預防和減輕這類光毒性給我們帶來的不利影響。

LUYOR-3450細胞光毒性輻照儀克服了現(xiàn)有的光毒性鑒定實驗設(shè)施所用的光源不純， 實驗效率低下，而且實驗條件惡劣，操作人員不安全。LUYOR-3450可以準確控制實驗精度、安全、方便、高效的紫外輻照儀。

細胞光毒性試驗原理

細胞光毒性是指應(yīng)用于機體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強（在低劑量水平時明顯）的毒性反應(yīng)，或全身應(yīng)用一種物質(zhì)后由皮膚光照引起的反應(yīng)。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴散的方式穿透細胞膜并在細胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學物質(zhì)和外界條件作用可引起細胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導致溶酶體脆性增高等不可逆的細胞毒性變化，從而導致細胞吸收中性紅的能力下降。

本試驗方法通過測定3T3成纖維細胞經(jīng)化學物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細胞吸收中性紅的能力或細胞毒性的變化來判斷該化學物質(zhì)是否具有光毒性。

細胞光毒性試驗材料與試劑

（一）光源類型

選擇合適的光源必須符合的標準包括：光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內(nèi)能達到的劑量）能滿足已知光毒性化學物質(zhì)的檢測。此外的波長和劑量不能有損于試驗系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似UVB波長的高細胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長，推薦使用LUYOR-3450細胞光毒性輻照儀。

由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當數(shù)量的UVB，應(yīng)經(jīng)過適當?shù)倪^濾使UVB＜0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強度建議為1.7mW/cm2光強度（即5J/cm2）劑量。

（二）細胞株

選用永生化小鼠成纖維細胞系—Balb/c 3T3成纖維細胞。要求細胞來源必須是具有公信力的機構(gòu)且能確保細胞品質(zhì)穩(wěn)定。

由于細胞對UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗的Balb/c 3T3成纖維細胞傳代次數(shù)好少于100次。

測試單位若自行培養(yǎng)細胞株，則須定期檢測細胞株對UV光的敏感性，并確保無支原體污染。

（三）培養(yǎng)基

采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。

（四）溶劑的選擇

在測定前，應(yīng)首先評價受試物的溶解度，以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學反應(yīng)，不影響細胞活性。

能溶于水且濃度達1000μg/mL的受試物可溶于預先加溫（37℃）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受試物（＜1000μg/mL）可用二甲基亞砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。

（五）受試物的配制

受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學物質(zhì)操作和細胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進行。

每次實驗應(yīng)設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照（推薦使用氯丙嗪）。加樣示意圖見附錄B。

（六）受試物劑量的設(shè)置

需通過預實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 ＝3.16）稀釋成8個濃度，相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從大細胞毒性至幾乎無細胞毒性濃度（細胞存活率在20%—的范圍）。

如果預實驗結(jié)果表明在濃度等于1000μg/mL時仍未出現(xiàn)細胞毒性，則建議高濃度為1000μg/mL；若出現(xiàn)細胞毒性的濃度低于1000μg/mL時，有細胞毒性的濃度少于三種，則需要進行重復試驗或使用更小的稀釋因子，直至出現(xiàn)有細胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，高濃度不能達到1000μg/mL，則以大溶解度時的濃度作為高濃度，避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。

如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時仍然不具有細胞毒性，而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強烈細胞毒性，則在-Irr試驗和+Irr試驗中可采用不同的試驗濃度。

（七）中性紅（Neutral Red，NR）

化學名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS編號:553-24-2；或藥品標準物質(zhì)，編號：100460。

（八）中性紅溶液

1．中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL蒸餾水（室溫條件下可保存2個月）

2．中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。

（九）中性紅解吸附溶液

將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存不超過1小時）。

細胞光毒性試驗步驟

（一）加100μL培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔（空白對照），在其余孔中加入100μL密度為1×105個細胞/mL的細胞懸液（即1×104細胞/孔）。每次試驗制備兩個板，包括相同的受試物濃度系列、溶劑對照、空白對照和陽性對照，一個板用于確定細胞毒性（-Irr），另一個板用于確定光毒性（+Irr）。

（二）培養(yǎng)細胞24小時（5%—7.5%CO2，37℃）直至它們形成單層半飽和細胞。該培養(yǎng)過程允許細胞恢復和粘連。

（三）去除培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS輕柔沖洗細胞一次或兩次。加入100μL含適當濃度受試物或溶劑的緩沖液到孔中。培養(yǎng)細胞1小時（5%—7.5%CO2，37℃）。

（四）在室溫下將其中一個板放入LUYOR-3450細胞光毒性輻照儀的輻照腔內(nèi)進行光照（+Irr）暴露，以1.7mW/cm2光強度透過96孔板蓋照射細胞50分鐘；同時將另一個平板無光照（-Irr）置于暗盒內(nèi)50分鐘。

（五）去除受試溶液，用150μL EBSS或PBS仔細沖洗細胞兩次。加入100μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜（18—22小時，5%—7.5%CO2，37℃）。

（六）在相差顯微鏡下檢查細胞，記錄受試物細胞毒性所致細胞形態(tài)學的改變，用于排除試驗誤差。

（七）中性紅吸收（NRU）測量。細胞吸收中性紅進入溶酶體和活細胞體內(nèi)空泡，可用作細胞數(shù)量和活性的定量指標。

1．用150μL預溫的EBSS或PBS沖洗細胞一次或兩次。輕柔拍打平板，去除沖洗溶液。加入100μL含50μg/mL中性紅的培養(yǎng)液，在5%—7.5%CO2，37℃和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細胞3小時。

2．去除中性紅培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS沖洗細胞一次或兩次。

3．輕輕倒出并吸干全部EBSS或PBS。

4．準確加入150μL中性紅解吸附溶液。

5．在微量滴定平板振蕩器上震蕩96孔板10分鐘，直至中性紅從細胞內(nèi)被提取出來，并形成均勻溶液。

6．用分光光度計或酶標儀測定中性紅提取物溶液在540nm波長處的光密度。用空白孔作為參考對照。

七、結(jié)果評判標準

（一）確定以光刺激因子（PIF值）為基礎(chǔ)的預測模型

1．通過分析在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細胞毒性濃度反應(yīng)曲線，確定能抑制50%細胞活性的受試物濃度（IC50），按下列公式計算光刺激因子（PIF）。

PIF＝IC50（-Irr）

IC50（+Irr）

評判標準：PIF≤2：預測“無光毒性”；PIF≥5：預測“有光毒性”。PIF介于2—5之間，需進行重復試驗；如果PIF仍介于2—5之間，預測“有潛在光毒性”。

2．如果受試物在有光照（+Irr）時有細胞毒性，無光照（-Irr）時無細胞毒性，且細胞毒性試驗所使用的濃度已達高受試濃度（Cmax）時，可按照下列公式計算＞PIF：

＞PIF＝Cmax（-Irr）/ IC50（+Irr）

評判標準為：如果只獲得一個“＞PIF”，那么任何＞PIF ＞1的值都能提示“有潛在光毒性”。

3．受試物在高濃度時仍未顯示任何細胞毒性，用“PIF＝*1”表示，提示“無潛在光毒性”。

（二）確定以平均光效應(yīng)（MPE值）為基礎(chǔ)的預測模型

通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細胞毒性濃度反應(yīng)曲線（i＝1，….，N）可得到平均光效應(yīng)（MPE），細胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）試驗共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度Ci的光效應(yīng)（PEi）等于濃度效應(yīng)（CEi）和反應(yīng)效應(yīng)（REi）的乘積。使用專門的軟件“PHOTO32或更高版本”求得平均光效應(yīng)（MPE），建立以平均光效應(yīng)（MPE）為基礎(chǔ)的預測模型。通過將MPE與臨界閾值MPEc比較，預測化學物潛在光毒性的預測模型。

閾值MPEc＝0.1

評判標準：

如果MPE≤0.1：預測無潛在光毒性；

如果MPE≥0.15：預測有潛在光毒性。

如果MPE介于0.1—0.15之間，需進行重復實驗；如果MPE仍介于0.1—0.15之間，預測有潛在光毒性。

上圖：LUYOR-3450細胞光毒性輻照儀