熒光顯微鏡的原理使用方法和注意事項(xiàng)

熒光顯微鏡工作原理

多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

1．激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別

熒光顯微鏡是利用紫外線為光源，用以照射被檢驗(yàn)的物體，使該物體發(fā)出光源，然后在顯微鏡下進(jìn)行對(duì)物體的觀察。主要是用于免疫熒光細(xì)胞，主要是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)組成的在通過(guò)目鏡和物鏡的放大來(lái)觀察樣本的熒光圖像。我們來(lái)看下這熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡有什么樣的區(qū)別。
1、在照明方式上看
熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說(shuō)光源是通過(guò)物鏡來(lái)投放于試驗(yàn)樣本上。

2、在分辨率上看
熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長(zhǎng)比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。
3、在濾光片上的不同
熒光顯微鏡是用了兩個(gè)特殊的濾光片，在光源前用是用來(lái)濾出可見(jiàn)光，在物鏡和目鏡之間的使用來(lái)濾出紫外線，這樣可以保護(hù)人的眼睛。
熒光顯微鏡也屬于光學(xué)顯微鏡的一種，主要是銀光顯微鏡所激發(fā)的波長(zhǎng)短，所以這才導(dǎo)致了熒光顯微鏡和普通顯微鏡雜結(jié)構(gòu)構(gòu)造和使用上的不同，熒光顯微鏡大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在極其微弱的熒光下，它的成像能力也和好。再加上近年來(lái)對(duì)熒光顯微鏡的不斷改善，噪音也大幅度降低。因此越來(lái)越多的熒光顯微鏡得到應(yīng)用。
以上是關(guān)于熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，了解這些以后，在鑒別是不是熒光顯微鏡會(huì)有很大的幫助。

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡區(qū)別及特性
熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同，它不是通過(guò)普通光源的照明觀察標(biāo)本，而是利用定波長(zhǎng)的光(通常是紫外光、藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本，不是由于光源的照明，而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。由此可知，熒光顯微鏡的特點(diǎn)，主要是它的光源能供給大量特定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強(qiáng)度的激發(fā)光。同時(shí)，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。熒光顯微鏡是**熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。
1.激發(fā)熒光的方式：按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見(jiàn)的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
2.BV激發(fā)法：是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過(guò)所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的大吸收波長(zhǎng)和熒光的大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較，可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無(wú)法看到，而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來(lái)判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時(shí)，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響大。

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡光源的區(qū)別
熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈，但近年來(lái)也使用高功率LED作光源，而普通光學(xué)顯微鏡通常只有鹵素或LED燈來(lái)照明。熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說(shuō)光源是通過(guò)物鏡來(lái)投放于試驗(yàn)樣本上，而普通光學(xué)顯微鏡是直接用光源照射樣品，從而進(jìn)行的觀察。在分辨率上講，熒光顯微鏡利用的是紫外線光源，波長(zhǎng)比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。在濾光片的使用上，熒光顯微鏡是用了兩個(gè)特殊的濾光片，在光源前的作用是用來(lái)濾出可見(jiàn)光，在物鏡和目鏡之間的作用是用來(lái)濾出紫外線，以保護(hù)觀察者的眼睛。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別大致就是這些。

熒光顯微鏡使用方法

1、用窗簾遮蔽光線，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風(fēng)良好、無(wú)遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉(zhuǎn)動(dòng)燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開(kāi)熒光顯微鏡電源開(kāi)關(guān)，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動(dòng)不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動(dòng)開(kāi)關(guān)點(diǎn)燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動(dòng)未點(diǎn)燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并達(dá)到Zda發(fā)光效率，即可開(kāi)始工作。
4、燈泡的使用調(diào)中：
①任選一塊標(biāo)本放在熒光顯微鏡載物臺(tái)上。
 ②轉(zhuǎn)動(dòng)鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉(zhuǎn)動(dòng)濾色片組轉(zhuǎn)換手輪，將紫光(V)或藍(lán)光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉(zhuǎn)入光路，并將25熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路。
③調(diào)節(jié)粗微調(diào)手輪，將標(biāo)本像調(diào)焦清晰。
④前后推動(dòng)垂直照明器右邊的聚光鏡調(diào)焦推桿，使視場(chǎng)光欄成像清晰，轉(zhuǎn)動(dòng)視場(chǎng)光欄撥桿將視場(chǎng)光欄收小，調(diào)節(jié)視場(chǎng)光欄調(diào)中螺釘使視場(chǎng)光欄居中，然后再將視場(chǎng)光欄開(kāi)至Zda。
⑤轉(zhuǎn)動(dòng)鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調(diào)節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場(chǎng)內(nèi)成像清晰。
⑥調(diào)整燈箱上的燈泡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調(diào)整反光鏡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開(kāi)。
⑧轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時(shí)視場(chǎng)照明均勻。
5、熒光顯微鏡使用過(guò)程中熒光觀察：
①將熒光染色標(biāo)本放到熒光顯微鏡載物臺(tái)上。
②將10x平場(chǎng)物鏡或25x熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路，調(diào)節(jié)載物臺(tái)縱橫移動(dòng)手輪，將標(biāo)本移入光路。
③轉(zhuǎn)動(dòng)濾光片轉(zhuǎn)換撥輪，將熒光染色標(biāo)本所需要的激發(fā)濾光片組轉(zhuǎn)入光路。激發(fā)濾光片組編號(hào)刻在濾片組轉(zhuǎn)換撥輪上。濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應(yīng)用的關(guān)鍵。選用濾光片時(shí)，必須遵守斯托克斯定律：激發(fā)濾光片的透射波長(zhǎng)<雙色束分離器的透射波長(zhǎng)<阻斷濾光片的透射波長(zhǎng)。
④調(diào)節(jié)粗調(diào)手輪，當(dāng)看清熒光圖像輪廓后，再用微調(diào)手輪調(diào)焦，直至看到清晰的熒光圖像。
⑤當(dāng)需要得到較強(qiáng)的熒光圖像時(shí)，可轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。
⑥當(dāng)需要使用40x或100x熒光物鏡觀察時(shí)，應(yīng)在標(biāo)本和物鏡間加上甘油，油中不能有影響觀察的小泡或雜質(zhì)。使用時(shí)可使甘油慢慢浸潤(rùn)一會(huì)兒，然后輕輕左右來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器以排除氣泡。

6、熒光顯微攝影
由于熒光圖像一般均較明場(chǎng)觀察暗得多，所以進(jìn)行熒光顯微攝影需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間，在曝光時(shí)應(yīng)注意避免熒光顯微鏡震動(dòng)。為了縮短曝光時(shí)間，可選擇倍率較低的攝影目鏡或感光度較高的攝影膠片如ASA200以上或DIN24以上。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

7、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上是可靠的。
8、熒光顯微鏡使用結(jié)束，關(guān)閉電源，做好鏡頭和載物臺(tái)的清潔工作，待燈室冷卻至室溫后，用防塵罩蓋好顯微鏡，并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用步驟

1.關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，開(kāi)啟顯微鏡汞燈；
2.根據(jù)樣品標(biāo)記的熒光素選擇相應(yīng)的濾光片；
3.放好樣品，找到合適的視野；
4.如需拍照，請(qǐng)確認(rèn)照相機(jī)內(nèi)已裝好彩色膠卷（zui好使用27定膠卷）；
5.開(kāi)啟自拍裝置，選擇手動(dòng)檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內(nèi)；
6.使用結(jié)束，關(guān)閉電源并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用注意事項(xiàng)

1、嚴(yán)格按照熒光顯微鏡說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
2、熒光顯微鏡應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。
3、防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。
4、檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過(guò)2～3h。
5、熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。
6、標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。
7、熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“-”表示無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光?！?”表示僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光?！?+”表示可見(jiàn)有明亮的熒光?！?++”表示可見(jiàn)耀眼的熒光。
8、其它注意事項(xiàng)、熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。