近紅外熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)

近紅外熒光蛋白是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，可利用自身特殊的結(jié)構(gòu)催化形成生色團(tuán)，且具備許多優(yōu)良的特點(diǎn)：
(1)易于檢測(cè)，靈敏度高，熒光性質(zhì)穩(wěn)定。熒光蛋白生色團(tuán)的成熟不需要添加底物或其他輔助因子，僅在激發(fā)光激發(fā)下就能發(fā)出熒光，單細(xì)胞標(biāo)記清晰，熒光顯微鏡下很容易觀察到；
(2)熒光蛋白基因編碼序列短，易構(gòu)建載體；
(3)細(xì)胞毒性小，可直接標(biāo)記活細(xì)胞或活體組織；
(4)相比于 GFP，它的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，位于近紅光區(qū)(650~900 nm)，在動(dòng)物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性[22]，更適宜于動(dòng)物活體組織的深層成像，是活體成像更為理想的熒光標(biāo)記分子。
本研究使用的近紅外熒光蛋白 iRFP682 的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為 663 nm 和 682 nm，是單體熒光蛋白分子，其發(fā)光性質(zhì)較為穩(wěn)定，較長(zhǎng)的光譜特點(diǎn)使其在活體動(dòng)物組織成像的應(yīng)用中更具潛力。

熒光蛋白作為標(biāo)記分子在生命科學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。熒光蛋白具備良好的性能，其在發(fā)揮標(biāo)記分子的作用中相比于傳統(tǒng)的生物標(biāo)記分子有諸多優(yōu)良特點(diǎn)，不需要額外的底物或輔助因子，僅在藍(lán)光或紫外激發(fā)下即可發(fā)出明亮的熒光，檢測(cè)方便且靈敏性高。熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光特性使其廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物等的研究中，涉及分子水平、細(xì)胞水平，再到動(dòng)物活體或全身成像等。

近紅外熒光蛋白（Near-infrared fluorescent protein，iRFP）是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，具備綠色熒光蛋白的發(fā)光優(yōu)點(diǎn)。但是，相比于GFP，它的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，位于近紅光區(qū)（650~900nm），在動(dòng)物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性，更適宜于動(dòng)物活體組織的深層成像，是深層成像更為理想的熒光標(biāo)記分子。

本文使用的iRFP713的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為690nm和713nm，是單體熒光蛋白分子，其發(fā)光性質(zhì)較為穩(wěn)定，較長(zhǎng)的光譜特點(diǎn)使其在活體動(dòng)物組織成像的應(yīng)用中更具潛力。 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是一種線性的單鏈DNA的微小病毒，分子量小，是當(dāng)前zui受歡迎的基因載體之一。AAV的基因組中有三個(gè)重要的結(jié)構(gòu)：ITR序列，Rep和Cap基因，ITR是AAV DNA兩端的倒置末端重復(fù)序列，是腺相關(guān)病毒載體不可或缺的順式作用元件。ITR自我互補(bǔ)形成倒T型結(jié)構(gòu)，能維持基因組穩(wěn)定，使外源基因能夠在細(xì)胞及動(dòng)物許多組織中長(zhǎng)期穩(wěn)定有效地表達(dá)。腺相關(guān)病毒無(wú)病原性，一般不會(huì)致病，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性，對(duì)生物機(jī)體安全，是較為安全的病毒載體。 本論文通過(guò)分子克隆等手段將iRFP713基因克隆到含AAV2的ITR序列的質(zhì)粒載體上構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pAAV-iRFP713。pAAV-iRFP713質(zhì)粒和pDG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞后，利用pAAV-iRFP713質(zhì)粒提供AAV2病毒所必須的ITR序列，輔助質(zhì)粒pDG提供AAV2重組復(fù)制、包裝病毒外殼等所必須的Rep和Cap基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝攜帶iRFP713基因的重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV ) rAAV-iRFP713。72h后收集重組病毒并分離濃縮純化，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定其拷貝數(shù)即物理滴度。 攜帶近紅外熒光蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒載體和重組病毒載體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在多種細(xì)胞中均能成功表達(dá)，細(xì)胞標(biāo)記效果良好。為了檢驗(yàn)iRFP713在動(dòng)物組織中的表達(dá)和成像效果，將重組病毒注射小鼠骨骼肌，在兩天，一周、兩周、一個(gè)月時(shí)在近紅外熒光活體成像系統(tǒng)觀察到熒光信號(hào)，表明腺相關(guān)病毒載體能攜帶近紅外熒光蛋白長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。 綜合上述，iRFP713基因表達(dá)穩(wěn)定，熒光信號(hào)強(qiáng)，是良好的細(xì)胞標(biāo)記分子。重組腺相關(guān)病毒攜帶iRFP713在小鼠骨骼肌中能長(zhǎng)久有效穩(wěn)定的表達(dá)。此外，利用腺相關(guān)病毒的定點(diǎn)整合特性，我們將建立一株穩(wěn)定表達(dá)iRFP713的乳腺癌細(xì)胞株。隨著研究的進(jìn)一步進(jìn)行，iRFP將在動(dòng)物腫瘤模型等活體動(dòng)物組織成像的研究應(yīng)用中表現(xiàn)更為優(yōu)越。