熒光顯微鏡常用的激發(fā)光源

作者：上海峰志時(shí)間：2020-02-11 10:32:05瀏覽9125 次

信息摘要：

熒光顯微鏡保留著顯微鏡功能的同時(shí)，還能進(jìn)行熒光觀(guān)察，具有檢出能力強(qiáng)，能進(jìn)行多重著色觀(guān)察的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。而熒光照明光源是熒光顯微鏡的關(guān)鍵部件，作用至關(guān)重要，既要考慮檢測(cè)樣本標(biāo)記的熒光探針吸收光譜，同時(shí)又要考慮儀器的使用簡(jiǎn)便性。

熒光顯微鏡常用LED激發(fā)光源特點(diǎn)

相對(duì)于一般的顯微鏡，熒光顯微鏡保留著顯微鏡功能的同時(shí)，還能進(jìn)行熒光觀(guān)察，具有檢出能力強(qiáng)，能進(jìn)行多重著色觀(guān)察的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。而熒光照明光源是熒光顯微鏡的關(guān)鍵部件，作用至關(guān)重要，既要考慮檢測(cè)樣本標(biāo)記的熒光探針吸收光譜，同時(shí)又要考慮儀器的使用簡(jiǎn)便性。

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在LED前，熒光顯微鏡常用光源為高壓汞燈，在LED激發(fā)光源普遍后，就成為熒光顯微鏡的主要光源。LED發(fā)射的單色光位于相對(duì)較窄的光譜帶中，半高寬約為10nm-40nm，相對(duì)于高壓汞燈，LED激發(fā)光源有幾個(gè)重要優(yōu)勢(shì)：

1）額定使用壽命可達(dá)3000小時(shí)以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他光源；

2）整個(gè)額定使用壽命期間，其輸出強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定，確保高效激發(fā)；

3）LED啟動(dòng)和關(guān)閉時(shí)間短，即開(kāi)即用，不需要預(yù)熱；

4）LED光效高，且亮度連續(xù)可調(diào)；

5）體積小、輕便，且為冷光源，彌補(bǔ)汞燈的大功率、發(fā)熱、使用復(fù)雜燈問(wèn)題，大大的降低了熒光顯微鏡使用成本并提高熒光顯微鏡操作的簡(jiǎn)便性。

對(duì)于熒光顯微鏡來(lái)說(shuō)，尤其是單色激發(fā)的熒光顯微鏡，LED具有非常大的吸引力，例如B波段激發(fā)的熒光探針FLTC/GFP標(biāo)記的樣板，在藍(lán)光LED激發(fā)下了可以獲得非常好的圖像，而廣泛應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)領(lǐng)域。上海峰志多波段LED顯微鏡熒光激發(fā)光源，多波段LED光源可選，并可控制每一個(gè)LED的亮度，可以實(shí)現(xiàn)多波長(zhǎng)的選擇激發(fā)，便捷、高效。

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熒光顯微鏡分析中常用激發(fā)光源的種類(lèi)

在熒光分析中常用汞燈作激發(fā)光源，根據(jù)汞蒸氣壓的不同可分為：

低壓汞燈

汞蒸氣，可發(fā)射出很強(qiáng)波長(zhǎng)的射線(xiàn)，壽命很長(zhǎng)，可長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)工作，射線(xiàn)對(duì)眼睛有害，不眼睛時(shí)不可長(zhǎng)時(shí)間注視。

高壓汞燈

高壓汞燈又叫高強(qiáng)度紫外線(xiàn)燈，汞蒸氣為1-數(shù)個(gè)大氣壓，可見(jiàn)炮區(qū)的譜線(xiàn)增強(qiáng)，在紫外光區(qū)，波長(zhǎng)為365nm的光線(xiàn)zui強(qiáng)。

中壓汞燈

可以發(fā)射一系列汞線(xiàn)組成的不連續(xù)光譜，除254nm波長(zhǎng)以外，多數(shù)譜線(xiàn)都可作為校正波長(zhǎng)使用。此外，還有超高壓汞燈、汞-氙燈、汞-鋅燈等。

氫灑和氘燈

是燈泡中加氫蒸氣，經(jīng)閉合放電產(chǎn)生160-350nm波長(zhǎng)的光，氫朋激發(fā)態(tài)返回的基態(tài)時(shí)，就發(fā)射了氫的連續(xù)光譜，在160nm以下為線(xiàn)樂(lè)譜，氫燈和氘燈性能相同，其壽命也比氫燈長(zhǎng)，因玻璃吸收紫外

線(xiàn)，故燈殼要用石英制作，或在燈泡出光處開(kāi)一石英窗，此光源適用于紫外光區(qū)的測(cè)定。

氙燈

紫外線(xiàn)燈的光的輻射能強(qiáng)度很高，它可在220-1100nm之間發(fā)射很強(qiáng)的連續(xù)光譜，可用于紫外區(qū)，可見(jiàn)光及近紅外區(qū)的測(cè)定，雖其輻射范圍廣，使用中在生產(chǎn)高熱的同晨有臭氧味，其壽命短，燈泡內(nèi)壓較大，如日立牌650-60型熒光分光光度計(jì)，氙燈平時(shí)約有7個(gè)大氣壓，點(diǎn)燃后可達(dá)30個(gè)大氣壓，故使用進(jìn)應(yīng)注意。

1、按裝緊固螺絲時(shí)用力應(yīng)均勻，勿成扭力，以免燈泡破裂爆炸。

2、勿用手觸及燈泡，以防受熱不均破裂。

3、如紫外線(xiàn)燈泡有油污，應(yīng)用雞皮藮酒精輕擦，不能用布、棉花等物擦拭。

熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式有哪些

熒光顯微鏡是科研、病理、檢驗(yàn)等部門(mén)常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一。因?yàn)槠胀ǖ娘@微鏡是在明亮的背景上觀(guān)察暗物，而熒光顯微鏡是在暗背景下觀(guān)察彩色的圖像，因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍，可以觀(guān)察到普通顯微鏡看不到的細(xì)節(jié)。但是它的調(diào)整，校正難度較高，只要解決了熒光顯微鏡的問(wèn)題，其它顯微鏡問(wèn)題就迎刃而解。

激發(fā)光源是熒光顯微鏡主要組成部分，熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作激發(fā)光源。它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充有一定量的汞，工作時(shí)在兩極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫光，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì)，因此被熒光顯微鏡普遍采用。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式：
按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線(xiàn)照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。

UV激發(fā)法是用短于400nm紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見(jiàn)的激發(fā)光，所以被觀(guān)察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光顯微鏡的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過(guò)所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的極大吸收波長(zhǎng)和熒光的極大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無(wú)法看到，而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來(lái)判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時(shí)，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響極大。