熒光蛋白激發(fā)光源用于棉花功能基因篩選

河南大學(xué)研究人員將LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源用于棉花功能基因篩選和視覺(jué)標(biāo)記

2022年初，河南大學(xué)在《Front Plant Sci.》期刊發(fā)表文獻(xiàn)《Optimizing the Protein Fluorescence Reporting System for Somatic Embryogenesis Regeneration Screening and Visual Labeling of Functional Genes in Cotton》，文獻(xiàn)中指出利用LUYOR-3415熒光蛋白激發(fā)光源能夠棉花基因的篩選?！　?/p>

蛋白質(zhì)熒光報(bào)告系統(tǒng)對(duì)于深入的生命科學(xué)研究至關(guān)重要，為體內(nèi)微觀生物活性的可視化提供了系統(tǒng)的標(biāo)記工具，并徹底改變了基礎(chǔ)研究。棉花體細(xì)胞再生效率低，造成棉花轉(zhuǎn)化困難。有利于利用熒光報(bào)告系統(tǒng)篩選轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞胚胎?！　?br/>

然而，目前棉花中可用的熒光標(biāo)記系統(tǒng)有限。為了優(yōu)化棉花的熒光報(bào)告系統(tǒng)，擴(kuò)大可用熒光蛋白的范圍，河南大學(xué)棉花實(shí)驗(yàn)室選擇了11種熒光蛋白，涵蓋紅色、綠色、黃色和青色熒光顏色，并用棉花表達(dá)。除mRuby2和G3GFP外，其他9種熒光蛋白(mCherry，tdTomato，sfGFP，Clover，EYFP，YPet，mVenus，mCerulean和ECFP)在轉(zhuǎn)基因愈傷組織和胚胎中穩(wěn)定而強(qiáng)烈地表達(dá)，并在來(lái)自不同的棉花器官中遺傳自篩選的胚胎?！　?br/>

此外，表達(dá)tdTomato的轉(zhuǎn)基因棉花在白光下呈粉紅色，不僅對(duì)愈傷組織、胚胎組織，而且對(duì)成熟植物的各種器官也呈粉紅色，為棉花遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程提供了視覺(jué)標(biāo)記，加速了轉(zhuǎn)基因事件的評(píng)價(jià)。河南大學(xué)棉花實(shí)驗(yàn)室在體內(nèi)構(gòu)建了表達(dá)mCherry標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞器標(biāo)記物，覆蓋了七個(gè)特定的亞細(xì)胞區(qū)室：質(zhì)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，土著體，線(xiàn)粒體，質(zhì)體，高爾基體和過(guò)氧化物酶體。河南大學(xué)棉花實(shí)驗(yàn)室還提供了一種簡(jiǎn)單而的策略，使用細(xì)胞器標(biāo)記物快速確定棉細(xì)胞中未表征蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位?！　?br/>

然后，河南大學(xué)棉花實(shí)驗(yàn)室建立了個(gè)使用氣孔特異性表達(dá)啟動(dòng)子(ProKST1，ProGbSLSP和ProGC1)的棉花氣孔熒光報(bào)告系統(tǒng)來(lái)驅(qū)動(dòng)三葉草表達(dá)。本研究中用于轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞胚胎篩選和功能基因標(biāo)記的優(yōu)化熒光標(biāo)記系統(tǒng)為加速體細(xì)胞再生效率和體內(nèi)監(jiān)測(cè)棉花中各種細(xì)胞過(guò)程提供了潛力?！　?br/>

用變焦立體顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花或煙草表皮細(xì)胞的胚胎愈傷組織，雄蕊，雌蕊，葉和種子組織中的熒光(奧林巴斯，東京，日本)。用共聚焦電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花原生質(zhì)體，氣孔細(xì)胞，纖維，葉表皮細(xì)胞和根部樣品中的熒光(尼康，東京，日本)。大于 2 厘米的轉(zhuǎn)基因樣品2使用LUYOR-3415RG手持熒光燈(中國(guó)上海LUYOR)進(jìn)行觀察，并使用EOS 800D相機(jī)(佳能，中國(guó)北京)拍攝圖像，并帶有LUV-495A和LUV-590A熒光拍照濾鏡(LUYOR)，用于綠色和紅色熒光觀察。使用濾光片?！　?br/>

該研究證實(shí)，LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源能夠觀察GFP、eGFP、dsred、Mcherry、Tdtomato等綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)。

FIGURE 1 Stable expression of red and green fluorescent proteins (RFPs and GFPs, respectively) in cotton callus and embryo tissues. The protoplast of transgenic callus expression empty vector, RFP (A) and GFP (B) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 20 μm. The transgenic embryo expression empty vector, RFP (C), and GFP (D) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 1 mm. RFPs: mRuby2, mCherry and tdTomato; GFPs: G3GFP, sfGFP and Clover.

FIGURE 2 Red fluorescent protein (RFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Transgenic cotton plants expressing RFP during vegetative growth showed red fluorescence in their whole aerial portions under excitation spectra; scale bar, 2 cm. (B–E) The root (scale bar, 100 μm), fiber (scale bar, 50 μm), stamen/pistil (scale bar, 2 mm), and seed (scale bar, 1 mm) of transgenic regenerated cotton plants expressing empty vector and RFP under white light (bright) and excitation light (fluorescence).

FIGURE 3 Green fluorescent protein (GFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Observation of green fluorescence under excitation spectra in aerial parts of transgenic cotton plants during vegetative growth stage; scale bar, 2 cm. (B–E) The root, fiber, stamen/pistil, and seed tissues of transgenic regenerated cotton plants under white light (bright) and excitation light (fluorescence). Scale bars (white) are defined in images. (F) Measurement of GFP in young and old leaf of transgenic cotton expressing Clover by western blot.

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河南大學(xué)棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2011年10月批準(zhǔn)成立，依托單位為河南大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。2014年1月通過(guò)建設(shè)期驗(yàn)收。2017年6月通過(guò)科技部輪五年評(píng)估，評(píng)估結(jié)果為“良好”?，F(xiàn)有固定人員30人，包括杰青1人，百千萬(wàn)人才工程入選者3人、國(guó)務(wù)院特殊津貼獲得者3人，中科院百人計(jì)劃專(zhuān)家1人，中原學(xué)者1人，中原-基礎(chǔ)研究領(lǐng)軍人才1人，河南省專(zhuān)家3人，河南大學(xué)“杰出人才特區(qū)支持計(jì)劃”及攀登計(jì)劃等校級(jí)特聘教授12人。在研自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等科研27項(xiàng)，科研經(jīng)費(fèi)3264.4萬(wàn)元。 2019年發(fā)表SCI論文51篇，申請(qǐng)專(zhuān)利4項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)室主要圍繞棉花生物學(xué)重大科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作，為棉花基礎(chǔ)創(chuàng)新提供源動(dòng)力，為棉花重大前沿問(wèn)題的解決提供支撐，為棉花高層次科研人才培養(yǎng)和交流提供平臺(tái)。主要研究方向包括：一、棉花基因組學(xué)及遺傳多樣性研究；二、棉花品質(zhì)生物學(xué)及功能基因研究；三、棉花產(chǎn)量生物學(xué)及遺傳改良研究；四、棉花逆境生物學(xué)及環(huán)境調(diào)控研究。

實(shí)驗(yàn)室擁有“作物光高效利用及耐逆多基因聚合分子設(shè)計(jì)育種”河南省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，“農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治”和“水分脅迫與植物次生代謝調(diào)控”兩個(gè)河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)。

擁有引智平臺(tái)1個(gè)（作物逆境生物學(xué)創(chuàng)新引智基地，“111計(jì)劃”）、省級(jí)引智平臺(tái)1個(gè)（河南省植物逆境多組學(xué)創(chuàng)新引智基地）和省級(jí)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室1個(gè)（河南省作物逆境多組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室）和“河南大學(xué)-亞伯大學(xué)多組學(xué)創(chuàng)新基地“，兼職工作的外籍專(zhuān)家包括美國(guó)科學(xué)院院士Alexander S. Raikhel教授等20余位學(xué)術(shù)大師和學(xué)術(shù)骨干。