常見熒光蛋白介紹

常見熒光蛋白：

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）

在光譜的綠光區(qū)（500nm-525nm）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種熒光蛋白，而且來源廣泛，包括不同種屬的Aequorea 、橈足類動物、文昌魚以及珊瑚。然而多數(shù)有齊聚反應，即使zui好的熒光蛋白與EGFP相比，也沒有明顯的優(yōu)點?；蛟S目前活細胞成像zui好的選擇是GFP衍生的Emerald（祖母綠），它與EGFP的特性相似。Emerald包含F(xiàn)64L 和S65T突變，另外還有四個點突變從而改進了折疊、37℃時的突變率以及亮度。雖然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些環(huán)境下其定量成像會受到影響。

上圖為在LUYOR-3415RG照射下葉片GFP發(fā)出綠色熒光（圖片轉(zhuǎn)自http://www.luyoruv.com,版權(quán)歸屬上海路陽生物技術(shù)有限公司，）

下面主要介紹GFP及其衍生型熒光蛋白：
（1）綠色熒光蛋白的來源
綠色熒光蛋白zui早由美籍日裔科學家下村修于1962年在水母中發(fā)現(xiàn)。這種蛋白質(zhì)在藍色波長范圍的光照激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，其發(fā)光過程需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，而且，這個冷光蛋白質(zhì)可與鈣離子（Ca2+）相互作用。在水母中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白的分子量較小，僅為27~30kDa，而編碼GFP的基因序列也很短，為2.6kb。
（2）綠色熒光蛋白性質(zhì)
GFP由238個氨基酸殘基組成。GFP序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發(fā)形成熒光發(fā)色基團——對羥基苯咪唑啉酮GFP的激發(fā)光譜在400nm附近有一個主激發(fā)峰，在470nm附近有一個次激發(fā)峰。發(fā)射光譜在505nm附近有一尖銳的主發(fā)射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化學性質(zhì)相當穩(wěn)定，無光漂白現(xiàn)象（Photobleaching），用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質(zhì)。在細胞生物學與分子生物學領域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報告基因。
（3）野生型綠色熒光蛋白

野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）從一開始就引起了人們極大的興趣，而且被用作新型的簡單報告基因及體內(nèi)標記，但GFP在異源生物體中的表達并非那么簡單。例如，研究人員很早就發(fā)現(xiàn)需要在較高的溫度下孵育才能在細胞或生物體中表達GFP，并且wtGFP在37℃的熱穩(wěn)定性差。這些都阻礙了它在轉(zhuǎn)基因中的應用。這些難題促使人們進一步篩選分離wtGFP的變體?，F(xiàn)在，人們已經(jīng)找到了熒光強度更強且更耐熱的變體。這些變體多數(shù)為經(jīng)突變的脫輔基蛋白，它們可防止高溫導致的錯誤折疊。近年來出現(xiàn)的新型wtGFP基因突變體的激發(fā)和發(fā)射譜發(fā)生了改變，熱穩(wěn)定性和熒光強度得到了提高，GFP報告基因在小鼠中的應用就是以這些變體作為基礎的。
（4）增強型綠色熒光蛋白（EGFP）
現(xiàn)在，應用zui為廣泛的是紅移變體增強型GFP（EGFP）。諸如EGFP這些紅移變體的zui大激發(fā)峰發(fā)生紅向移動，大約為490nm，這一波長也恰好是多數(shù)分光設備、流式細胞儀及共聚焦顯微鏡的常用波長。EGFP有兩個氨基酸突變，當被藍光激發(fā)時，它發(fā)出的熒光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在內(nèi)的多數(shù)變體半衰期長，所以不適合追蹤表達的減少或損耗。
（5）不穩(wěn)定增強型綠色熒光蛋白（dEGFP）
為克服這一問題，人們在1998年構(gòu)建了不穩(wěn)定增強型綠色熒光蛋白（dEGFP）。原理就是將EGFP的cDNA融合到小鼠鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一個PEST序列，這個序列可促進該蛋白在細胞內(nèi)的降解。雖然，目前這些不穩(wěn)定變體還沒有在小鼠中應用，但這些變體有利于實時追蹤基因表達動力學的研究。
（6）增強型黃色熒光蛋白（EYFP）
另一種紅移變體是增強型黃色熒光蛋白（EYFP），該變體有四個氨基酸突變。在527nm時，EYFP的發(fā)射光從綠色變?yōu)辄S綠色。EYFP熒光的亮度水平與EGFP相當。EYFP 抗酸性差、對鹵化物敏感，使它的應用受到限制。在EYFP 基礎上改進的突變體mCitrine[21]和mVenus[22]是目前應用zui多的黃色熒光蛋白。
（7）增強型藍色熒光蛋白（EBFP）
在光譜的另一端是藍色/藍綠色變體，包括增強型藍色熒光蛋白（EBFP）變體。它有四個氨基酸突變，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380nm和440nm。由于這些突變改進了蛋白折疊和發(fā)色團形成的效率，所以也增強了所發(fā)出熒光的亮度（與藍色變體相比）和蛋白溶解性。但的不足之處，就是EBFP產(chǎn)生的熒光信號
大致與wtGFP相當。藍色熒光蛋白發(fā)光較弱，抗光漂白和抗酸性較差，用于細胞成像時背景信號高。針對EBFP開發(fā)的3個更亮的突變體：Azurite (亮度是EBFP 的1.6 倍)、EBFP2(亮度是EBFP的2倍，mTagBFP(亮度是EBFP的3.7倍)。zui亮的藍色熒光蛋白。mTagBFP 是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來。
（8）增強型藍綠色（青色）熒光蛋白（ECFP）
增強型藍綠色熒光蛋白（ECFP）是發(fā)出藍色/藍綠色熒光的另一種變體，產(chǎn)生的熒光信號要比wtGFP強。ECFP有六個氨基酸突變（表3），發(fā)射光譜從綠色遷移到藍綠色，zui大激波長在433nm（主峰）和453nm（次峰），zui大發(fā)射在475nm，于510nm處有一肩峰（圖11）。ECFP另一特點是比其它藍色/藍綠色變體光漂白效應弱，而且比EBFP的亮度強。值得一提的是，wtGFP的主要綠色熒光變體，如EGFP等已經(jīng)在ES細胞、基因打靶和轉(zhuǎn)基因小鼠研究中得到充分應用。

藍色及藍綠色熒光蛋白

雖然EBFP是Aequorea GFP來源的zui早的光譜變體之一，但其亮度低、光穩(wěn)定性差，使其很久以來沒有引起多數(shù)研究者的注意。zui近，有三個研究小組報道指出，改進的藍色Aequorea 熒光蛋白變體與EBFP相比，亮度和光敏感性有明顯增強。這些新的變體被命名為Azurite（石青或藍銅礦）、強力增強型藍色熒光蛋白2（strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2）及EBFP2，它們次使得活細胞在藍色光譜區(qū)域成功地長時間成像成為可能。即使這三種熒光蛋白在高濃度的微環(huán)境中表現(xiàn)出很弱的二聚體特性，但是它們能夠在與亞細胞定位的靶蛋白融合中有效地發(fā)揮作用，并且它們能夠很容易地通過濾光片設備與標準的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）一起成像。這些BFP變體都可以通過A206K突變改造成真正的單體，而且這種突變不會影響它們的特性。更重要的是，亮度zui強、光穩(wěn)定性zui強的藍色熒光蛋白EBFP2，是EGFP在活細胞中FRET的很好的供體。

黃色熒光蛋白

熒光蛋白的改造遵循這樣一個宗旨，那就是越紅越好.普遍認為，長波長光子的激發(fā)對細胞和組織的光毒性小，且自體熒光和動物組織的光吸收都是zui小。這些因素意味著紅色的熒光基團對比度提高（因為背景應該降低），且更適合于體內(nèi)成像。于是，熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。
黃色熒光蛋白zui早的變體EYFP（表6）雖然仍被廣泛應用，但由于其pK a值高、對鹵化物敏感，導致EYFP的應用還很不理想。單體形式的變體檸檬黃（mCitrine）和維納斯（mVenus）是目前應用zui多的黃色熒光蛋白探針，但二者都還沒有商業(yè)化。然而與之相似的，來源于Aequorea 被命名為誕生石Topaz（黃玉）的變體可從Invitrogen公司買到。
另一種很有應用潛力的黃色熒光蛋白是能量轉(zhuǎn)移黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet），它經(jīng)合成的DNA重排獲得，與熒光激活的細胞分選術(shù)結(jié)合能夠增強FRET中藍綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的配對。YPet是已經(jīng)開發(fā)的亮度zui強的黃色熒光蛋白，并且有很好的光穩(wěn)定性。YPet對酸性環(huán)境的耐受性要比mVenus及其它黃色熒光蛋白變體強。

橙色熒光蛋白

在橙色和紅色波長（約560nm到650nm）光譜區(qū)僅僅開發(fā)了幾種探針。盡管如此，現(xiàn)有的這幾種光譜型的蛋白都是從珊瑚中分離得到的，并且在多種成像情景中顯現(xiàn)出應用潛力，但在對橙色區(qū)域熒光蛋白的命名中存在混亂。通常被命名為紅色熒光蛋白RFP的探針如DsRed、TagRFP及tdTomato，實際上具有明顯的橙色多于紅色的發(fā)射譜。不考慮顏色的指示，用標準的四甲基羅丹明異硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）濾光片設備，橙色光譜型的蛋白在多種顏色，如藍綠色、綠色和紅色情景中更易于成像。

紅色熒光蛋白

紅色熒光蛋白(drFP583 )是人們從珊瑚蟲Discosoma gen。中克隆的一種與綠色熒光蛋白(GFP)同源的熒光蛋白，在紫外光的照射下可發(fā)射紅色熒光，有著廣泛的應用前景;但它自身的缺點如寡聚化、成熟緩慢等限制了它的進一步應用。因此，人們對它進行了一系列修飾和改進，得到了寡聚化程度低(甚至單體)和成熟速率快的突變體，Clontech公司已將一種突變體商業(yè)化，命名為DsRed。與GFP 相比，DsRed的激發(fā)和發(fā)射波長較長，其發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)器材及細胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比;而且在細胞內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高，更易檢測。較早報道的紅色熒光蛋白(DsRed) 的突變體有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和mCherry。
在活細胞及動物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。zui新研究進展是，通過mRFP1（表6）發(fā)色團殘基的直接突變產(chǎn)生的新的熒光蛋白，得到的單體熒光蛋白發(fā)射峰在560nm～610nm，并以相應的水果名字來命名。這其中mStrawberry和mCherry，發(fā)射峰分別為596nm和610nm（表6，圖22k），亮度分別為EGFP的75%和50%左右。mCherry的光穩(wěn)定性要遠強于mStrawberry，所以長期成為成像實驗中mRFP1zui好的替代品。這些以水果命名的熒光蛋白單體與mKO和TagRFP共同填補了水母紅移熒光蛋白（如YPet）與大量低聚紅色珊瑚熒光蛋白間的空白，并且目前已經(jīng)商業(yè)化。雖然，某些熒光蛋白缺乏許多成像實驗所需要的亮度和光穩(wěn)定性，但是它們的存在提示我們，zui終可以找到跨越整個可見光譜的亮度高、穩(wěn)定性強的單體探針。

熒光蛋白突變體