弧菌(vibrio)是水產(chǎn)品中為常見的致病菌，副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是我國主要水產(chǎn)源致病菌，由該菌引起的食物中毒事件居細(xì)菌性食物中毒事件的首位，同時也被視為范圍內(nèi)導(dǎo)致腹瀉類疾病的為主要因素之一?；魜y弧菌(vibrio cholerae)是導(dǎo)致人體產(chǎn)生霍亂疾病的主要源頭，流行廣泛且屬于烈性傳染病之一，曾多次引起大面積的疾病，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，如何快速、精準(zhǔn)和高效地檢測水產(chǎn)品中致病弧菌具有重要意義。
傳統(tǒng)定量檢測食品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的方法通常需要1周時間，基于dna的 qpcr定量技術(shù)雖簡便快捷，但無法區(qū)分樣品中死菌和活菌，容易導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象。光敏型核酸染料疊氮溴化丙錠(pma)與qpcr技術(shù)相結(jié)合，可以選擇性地識別水產(chǎn)品中的活菌dna，可用于進(jìn)行活菌定量檢測。pma前處理包括暗處理和光交聯(lián)兩個關(guān)鍵步驟，傳統(tǒng)的 pma前處理方法通常在一個密閉的環(huán)境進(jìn)行暗處理，手持600w左右的鈉鎢燈進(jìn)行光交聯(lián)，過程繁瑣，全程人工操作費時耗力；基于藍(lán)光led管的光交聯(lián)儀器LUYOR-3419PMA光解儀可大大簡化pma前處理過程。
實時熒光定量PCR 即qPCR 技術(shù)作為特定核酸片段走量的金標(biāo)準(zhǔn)，是目前應(yīng)用為廣泛和有效的核酸分子走量手段?？紤]到細(xì)菌數(shù)量和其含有的特定核酸分子(如16S rDNA)里正比例關(guān)系，因此qPCR 技術(shù)也被用于細(xì)菌定量檢測領(lǐng)域中o 然而在實際的微生物生態(tài)體系中，有活細(xì)菌也存在著死細(xì)菌;死細(xì)菌雖然己經(jīng)死亡，但其DNA 會在較長時間內(nèi)存在，因此采用qPCR 定量反映的是某種菌總菌的結(jié)果。對于微生物體系的解析尤其涉及生態(tài)功能的分析， ~t 細(xì)菌的數(shù)目更加能反映該種菌在生態(tài)體系中發(fā)揮的實際影響和作用，因此如何排除死細(xì)菌的干擾準(zhǔn)確定量活細(xì)菌變得十分重要，由此催生了PMA-qPCR 等活細(xì)菌的定量分析技術(shù)。
疊氮澳化丙鏈(Propidium Monoazide ， PMA) 是一種對核酸具有高度親和力的光敏染料，由于不能透過完整的細(xì)胞膜， PMA 只能修飾細(xì)菌死亡后暴露出來的DNA 分子。用合適濃度的PMA 處理的細(xì)菌樣品暴露于強(qiáng)光下時， PMA 所帶的光敏性疊氨基團(tuán)轉(zhuǎn)化為高潔性的氮賓自由基，并與結(jié)合位點附近的任意碳?xì)浠衔锓磻?yīng)形成穩(wěn)定的共價氮碳鍵。這樣使得死細(xì)菌的DNA 獲得修飾，導(dǎo)致其DNA 分子的qPCR 擴(kuò)增被阻斷;而活細(xì)菌則不受影響。相關(guān)研究表明， PMA 與qPCR 技術(shù)結(jié)合后可有效的抑制死細(xì)菌DNA 的擴(kuò)增，因此PMA-qPCR 技術(shù)是一種能有效用于細(xì)菌活細(xì)胞定量檢測的分子手段，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于致病菌或有害菌活菌的定量檢測等領(lǐng)域中。
PMA 對死細(xì)菌DNA 的共價結(jié)合效率受到多種因素的影響，主要因素有細(xì)菌種類、菌液濃度、PMA 濃度和曝光時間等。PMA 濃度和曝光時間的選擇在于:PMA 濃度過低或曝光時間過短則不能充分結(jié)合和修飾死細(xì)菌的DNA; 而PMA 濃度高到一定程度則會有不容忽視數(shù)量的PMA 分子滲透進(jìn)活細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，長的曝光時間將增強(qiáng)其對活菌DNA 的結(jié)合和修飾作用。因此采用PMA-qPCR 對某一研究體系中特定活細(xì)菌進(jìn)行走量檢測時，往往先在固定的純菌濃度下探究佳的PMA 處理濃度和曝光時間，之后用于實際從而達(dá)到更高的準(zhǔn)確率。
PMA -qPCR ~t菌檢測方法的建立與應(yīng)用
(1)制備細(xì)菌懸液:培養(yǎng)好純菌后，適當(dāng)稀釋到一定濃度(如OD600=1，即經(jīng)過稀釋使得在600nm 下的吸光值為1)，取若干份等體積的菌，其中一半采用加熱和超聲處理結(jié)合制備死菌樣品，而另外一半不做處理為活菌樣品;
(2) PMA 處理:在不同的PMA 濃度和曝光時間下處理(1)中的活菌組和死菌組樣品;
(3) qPCR 擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析:提取(2) 中經(jīng)PMA 處理的樣品的基因組DNA ，以此為模板采用該細(xì)菌特異性的qPCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到各組的Ct 值(qPCR 熒光闊值同擴(kuò)增曲線交點對應(yīng)的循環(huán)數(shù))綜合分析選出佳的PMA 處理條件。低的PMA 濃度和曝光時間為死細(xì)菌組Ct 值穩(wěn)定時(即不隨PMA 濃度和曝光時間的增加而發(fā)生顯著的增高，如Ct 值增量不超過1)的處理濃度和時間，高的PMA 濃度和曝光時間為活細(xì)菌Ct 穩(wěn)定時的處理濃度和時間;而佳的PMA 處理條件則在高和低的PMA 濃度和曝光時間之間的實際處理條件中擇優(yōu)選定，這樣在保證充分抑制死細(xì)菌DNA 擴(kuò)增的同時又不會影響到活細(xì)菌DNA 的擴(kuò)增。
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